摘要:為了充分發(fā)揮和提高優(yōu)良種公羊的利用率，提高綿羊凍融精液品質(zhì)，試驗采用酶動力學分光度法對冷凍保存前后小尾寒羊精子和精清中ATP酶活性變化進行研究。說明凍融過程對綿羊精子中ATP酶的活性造成了嚴重損傷。綿羊凍融精子ATP酶的活性可以在一定程度上預測精子活率，并可作為綿羊精液品質(zhì)評價的重要指標。氣相液氮罐

1材料與方法

1.1主要試劑

甘油、D-（+）-葡萄糖、蔗糖、青霉素、鏈霉素，檸檬酸鈉、氯化鈉、0.2%TritonX-100、Tris-HCl緩沖液（0.1mol/L，pH值8.2）、ATP溶液，分析純。

1.2主要儀器

高速離心機（型號為ZONKIAHC–2518），紫外可見分光光度計（型號為TU-1810PC/SPC），顯微鏡（型號為CKX31）。

1.3稀釋液的配制

取基礎(chǔ)液（葡萄糖3g，蔗糖4g，檸檬酸鈉3g，超純水100mL，煮沸消毒）80mL，加20mL新鮮卵黃液，青霉素、鏈霉素各10萬IU配制成保存稀釋液；再取上述溶液94mL加入甘油6mL，配制成冷凍稀釋液。

1.4精液采集與常規(guī)品質(zhì)評定

選取膘情中等、體質(zhì)健康、性欲旺盛的小尾寒羊種公羊，用假陰道法采集精液，立即在37℃下進行常規(guī)品質(zhì)評定，要求原精液密度達到“密”級，活率在0.8以上，無異常氣味，色澤乳白，用于試驗。

1.5 精液冷凍保存與解凍

1.5.1 精液的稀釋與平衡精液常規(guī)檢查后，將符合要求的新鮮精液根據(jù)活率和密度按3～6倍的比例，在35℃下用冷凍稀釋液等溫稀釋，混勻，在室溫下用0.25mL的塑料細管進行分裝并封口。裹8～10層紗布置于4℃冰箱中平衡2～3h。

1.5.2 精液的冷凍與保存將平衡好的精液細管置于自制冷凍漂浮器上（距離液氮表面2.0～2.5cm，溫度在-110～-80℃）熏蒸10min，投入液氮保存。

1.5.3 精液的解凍從液氮罐中取出精液細管，迅速浸入39～40℃水浴中，輕輕搖動直至融化（10～15s）。

1.6 精子活率的評定將稀釋精液搖勻后，取中層精液10μL滴于經(jīng)37℃恒溫板等溫預熱的載玻片上，蓋片后置于顯微鏡下放大400倍檢查精子1000個以上，分別計算呈直線運動精子數(shù)和總精子數(shù)，計算精子活率。

1.7 ATP酶活性的測定

1.7.1 ATP酶的提取精液總ATP酶粗提液:取120μL稀釋精液于離心管中，加入360μL0.2%TritonX-100，抽提20min，然后4000r/min離心30min，保留上清液待測。精清中ATP酶粗提液:取120μL稀釋精液于離心管中，加入自制稀釋液360μL2000r/min離心20min，保留上清液待測。精子中ATP酶粗提液:將上一步所得沉淀加入0.2%TritonX-100360μL抽提20min，4000r/min離心30min，保留上清液待測。

1.7.2 ATP酶活性的測定取純化水2.21mL，ATP溶液1.10mL，混勻后加入25℃預熱的ATP酶待測液0.19mL（空白管用純化水代替），迅速搖勻倒入比色皿（光徑為1cm），700nm處每隔1min測定1次OD值，每次測5min。

1.7.3 ATP酶活性的計算公式為:酶活力=（測定管OD值-對照管OD值）×1/（60×取樣量）×樣品稀釋倍數(shù)。氣相液氮罐

1.8 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，差異顯著性采用Excel軟件中數(shù)據(jù)分析工具庫進行描述統(tǒng)計、t檢驗和方差分析。試驗重復5次以上。

2.結(jié)果與分析

結(jié)果見表1。由表1可見，與冷凍前相比，冷凍后小尾寒羊精子中ATP酶活性極顯著降低（P＜0.01），精清中ATP酶活性極顯著升高（P＜0.01），說明冷凍保存對綿羊精子中ATP酶的活性造成了嚴重損傷。冷凍前后精子活率與精子ATP酶活性均呈極顯著正相關(guān)（r=0.979和0.968，P＜0.01），說明精子ATP酶活性能夠反映精子活率，可作為精液品質(zhì)評價的指標。